Fu l'illustre cardinale Ildefonso Schuster, negli anni '30, ad avere per primo l'idea di creare un museo diocesano in cui conservare le ricchezze artistiche della Chiesa ambrosiana, individuando come sede i chiostri della basilica di Sant'Eustorgio. Purtroppo l'ex monastero agostiniano, già allora in stato di abbandono, subì ulteriori, pesantissimi danni durante l'ultima guerra.
Nel 1960 l'arcivescovo Montini (il futuro Paolo VI) avviò le prime trattative tra il Comune e l'Opera Diocesana, ma la grande operazione ricostruttiva prese corpo soltanto verso la fine degli anni '80. L'Arcidiocesi affidò alla Società Stelline il compito di coordinare l'intervento di restauro, progettato da uno dei nomi più prestigiosi dell'architettura italiana: lo Studio Belgiojoso.
Il primo nucleo del museo venne inaugurato nell'89 e definitivamente e interamente aperto ai visitatori nel 2001.