Nella Dama con l'ermellino possiamo cogliere il primo atto di un processo rivoluzionario, che non solo comporta l'abbandono della iconografia tradizionale della ritrattistica, con il personaggio visto di profilo, ma che introduce nel ritratto i "moti dell'animo": emozioni e pensieri che si riflettono nei gesti e nelle attitudini, come Leonardo andava teorizzando negli appunti poi confluiti nel Trattato della Pittura.

La Dama si configura quindi, nel 1489/90, come una prima applicazione ad un "ritratto di naturale'' (ossia dal vero) delle teorie artistiche vinciane e come il "primo ritratto moderno della storia''.

Annotazioni come: "osservare il decoro, cioè che li movimenti siano annunziatori del moto de l'animo del motore'', ove si indica la stretta relazione esistente tra sentire interiore e movimento del corpo, oppure "Non usare mai fare la testa volta dov'è il petto..." o ancora "In che termine si de' ritrarre un volto a dargli grazia d'ombre e lumi'' trovano immediato riscontro nella Dama con l'ermellino.

Nel dipinto, infatti, il movimento, i gesti e gli sguardi sembrano fissare, come in un'istantanea, un attimo della vita e del pensiero della fanciulla ritratta, il suo moto e il fiato''. Giustamente Bellincioni nel sonetto da lui dedicato all'opera leonardesca (1493) poteva dire "la fa' che par che ascolti, e non favella''.

Il processo di indagine di Leonardo era però in quegli anni molto più ampio: gli si era dispiegata davanti la vastità della natura e dell'universo come un intreccio di forze in tensione e in conflitto; aveva avuto l'intuizione che l'artista doveva confrontarsi con la sfida della conoscenza, superando il tradizionale status di artigiano: Come il pittore non è laldabile se quello non è universale"; aveva quindi iniziato ad esplorare, servendosi anche del disegno, l'ampio mondo della natura e dell'anatomia.

Questi studi si rispecchiamo tutti nei dipinti coevi, quali ad esempio la Vergine delle rocce (Parigi, Louvre), e non appare casuale che proprio il disegno per la testa dell'angelo di sinistra di quest'opera (Torino. Biblioteca Reale) venga messo in rapporto con la Dama dell'ermellino. Lo studio, per il quale secondo alcuni posò la stessa Cecilia Gallerani, costituisce, nel suo contrapposto. l'immediato antecedente della Dama: come quest'ultima anch'egli si volta verso di noi coinvolgendoci con Io sguardo e il gesto nel suo spazio.

La Dama però guarda altrove, verso qualcuno che appartiene al suo mondo e non al nostro, e dal quale rimaniamo esclusi: questo fa si che si crei nel quadro una tensione o una sospensione misteriosa, accresciuta dalla presenza enigmatica dell'ermellino.

Mentre della donna raffigurata, infatti, molto pensiamo di sapere tanto da immaginare anche chi possa essere la persona cui si rivolge, l'ermellino sembra contenere in sé una molteplicità di rimandi e di significati che forse non ne esauriscono il mistero.

Il suo nome in greco suona γαλή , evocando subito il cognome Gallerani, ma contemporaneamente l'animale sembra alludere allo stesso Ludovico il Moro che era soprannominato "Italico Morel, bianco Ermellino" (Bellincioni) e che, nel 1488, aveva ricevuto dal re di Napoli l'Ordine dell'Ermellino.

Nel Bestiario di Leonardo, infine, ispirato da diversi testi tra cui il Fior di Virtù, l'ermellino è il simbolo della ''moderanza" o misura, virtù principe "che si è: voler aver modo in tute le sue cose schivando sempre lo tropo el poco honestamente", virtù che si accompagna alla "cortesia" e "gentilezza'', così come l'ermellino è uno animale più moderato e cortese e zentile che sia al mondo".