La Dama con l'Ermellino è dipinta a olio su una tavola sottilissima di legno di noce (così come prescritto da Leonardo stesso) di spessore variabile fra i 4 e i 5 millimetri; misura cm 40,5 x 55. Leonardo ha steso sulla tavola una preparazione bianca sulla quale ha poi sovrapposto uno strato di tono brunastro e, finalmente, i colori. La tavola fu attentamente esaminata nei Laboratori di Varsavia all'inizio degli anni cinquanta da K. Kwiatkowski che ne pubblicò i risultati nel 1955. Nel 1992 il dipinto fu nuovamente esaminato nei Laboratori della National Gallery di Washington, da David Bull. Da queste analisi e da un esame diretto della tavola si possono desumere le seguenti informazioni incontrovertibili:

• La tavola non è mai stata ridotta né alterata nelle sue dimensioni: lungo i bordi corre una zona risparmiata dalla pittura di circa 3-4 millimetri; forse Leonardo collocò la tavola in una cornice o in listelli di legno per poterla maneggiare meglio in corso d'opera.

• Il dipinto è in buono stato di conservazione e non presenta estesi rifacimenti se non nello sfondo, sul quale è stato steso uno strato di colore nero uniforme, probabilmente tra il 1830 e il 1870, dopo che l'angolo superiore sinistro della tavola si é spezzato (anche la scritta che si trova in quest'angolo fu dipinta nell'ottocento, forse quando l'opera entrò a far parte della collezione Czartoryski) Ilcolore originario del fondo, ancora visibile a distanza ravvicinata in alcuni punti, è grigio-azzurro scuro. Alcuni studiosi ipotizzano che la pittura nera sia opera di Eugène Delacroix, quando il dipinto si trovava a Parigi.

• Altri circoscritti ritocchi moderni (in punta di pennello rosso) si notano tuttavia sugli occhi, sulla punta del naso e sulla bocca. La cuffia di velo che ricopre i capelli è stata rinforzata con pennellate ocra sotto al mento. Per il resto, la pittura è originale e permette, in alcuni punti, di osservare anche il disegno preparatorio.

• il braccio e la mano sinistra sono completamente autografi, nonostante siano piuttosto appiattiti (alcuni studiosi avevano sospettato rifacimenti moderni in questa zona). Leonardo ha volutamente lasciato questa parte in ombra ma ha rifinito, come di consueto, gli orli dell'abito con nodi intrecciati in oro, segno dell'autenticità della pittura anche in queste parti poco illuminate.

• Kwiatkowski ha notato che il mantello dell'animale è stato dipinto con la mano sinistra e che la crettatura stessa della pittura rivela la presenza di un disegno a tratteggio eseguito con la mano sinistra nello strato inferiore. Ci sono inoltre tracce dl spolvero (lasciate da un cartone bucherellato attraverso il quale passa la polvere per definire i contorni) e di linee incise con una punta come sul naso e sulla mano destra.

• Si notano inoltre impronte digitali sulla testa dell'ermellino, sulla guancia e la fronte della Dama. indizi della lavorazione della superficie pittorica effettuata con i polpastrelli delle dita, come è tipico di Leonardo ( impronte simili si ritrovano sulla Ginevra de Benci di Washington, sul Battesimo di Cristo degli Uffizi, sulla Vergine delle Rocce del Louvre).

• Le radiografie eseguite negli anni cinquanta facevano sospettare che, in origine, Leonardo avesse previsto una finestra o un arco, nello sfondo a destra. Radiografie e riflettografie più recenti hanno escluso questa possibilità e, malgrado la ridipintura scura del fondo, la composizione appare tuttora come la ideò Leonardo stesso.